Sterilisasi Alat Dan Bahan Pada Pengujian Mikrobiologi

 

Steril merupakan syarat mutlak keberhasilan kerja dalam lab mikrobiologi. Dalam melakukan sterilisasi, diperlukan teknik-teknik agar sterilisasi dapat dilakukan secara sempurna, dalam arti tidak ada mikroorganisme lain yang mengkontaminasi media. Sterilisasi adalah proses untuk menjadikan alat-alat terbebas dari segala bentuk kehidupan. Seperti yang telah disebutkan bahwa tujuan sterilisasi untuk mematikan mikroorganisme yang tidak diinginkan agar tidak ikut tumbuh, atau suatu proses untuk membunuh semua jasad renik yang ada, sehingga jika ditumbuhkan di dalam suatu medium tidak ada lagi jasad renik yang dapat berkembang biak. Sterilisasi harus dapat membunuh jasad renik yang paling tahan panas yaitu spora bakteri atau pemusnahan atau eliminasi semua mikroorganisme, termasuk spora bakteri, yang sangat resisten
 

Jenis Metode Sterilisasi

Sterilisasi alat dan bahan pada pengujian mikrobiologi, Ada 5 metode umum sterilisasi, yaitu:
1. Sterilisasi uap (panas lembap)
Ini merupakan metode sterilisasi yang biasa digunakan dalam industri farmasi, karena dapat diprediksi dan menghasilkan efek dekstruksi bakteri, dan parameter-parameter sterilisasi seperti waktu dan suhu dapat dengan mudah dikontrol dan monitoring dilakukan sekali dalam satu siklus yang divalidasi.
Prinsipnya adalah dengan cara mengkoagulasi atau denaturasi protein penyusun tubuh mikroba sehingga dapat membunuh mikroba.

Digunakan untuk sterilisasi alat gelas, larutan yang dimaksudkan untuk diinjeksikan ke dalam tubuh, alat berskala, bahan karet. Sterilisasi ini dilakukan dengan autoklaf. Waktu yang dibutuhkan untuk sterilisasi larutan suhu 121 C adalah 12 menit dan menggunakan tekanan 15 psi (2 atm). Uap jenuh pada suhu 121 C mampu membunuh secara cepat semua bentuk vegetatif mikroorganisme dalam 1 atau 2 menit. Uap jenuh ini dapat menghancurkan spora bakteri yang tahan pemanasan.

Keefektifan sterilisasi uap bertekanan tergantung pada 4 sifat dari uap jenuh kering yaitu:
· Suhu
· Panas tersembunyi yang berlimpah
· Kemapuan untuk membentuk kondensasi air
· Kontraksi volume yang timbul selama kondensasi

Hal yang perlu diperhatikan bila mengerjakan sterilisasi dengan menggunakan autoklaf:
- harus ditunggu selama bekerja
- hati-hati bila mengurangi tekanan dalam autoklav (perubahann temperatur dan tekanan secara mendadak dapat menyebabkan cairan yang disterilkan meletus dan gelas-gelas dapat pecah).

2. Sterilisasi panas kering
Sterilisasi panas kering adalah metode yang paling efektif untuk alat-alat gelas yang tidak memiliki skala/ukuran misalnya: petri, tabung gelas, botol pipet, kemudian alat-alat bedah, dan bahan yang karena karakteristik fisikanya tidak dapat disterilisasi dengan uap destilasi dalam udara panas-oven, seperti minyak lemak, paraffin, petrolatum cair, gliserin, propilen glikol, serbuk steril seperti talk, kaolin dan ZnO, dan beberapa obat yang lain.

Sterilisasi ini dilakukan dengan oven pensteril. Prinsipnya adalah protein mikroba pertama-tama akan mengalami dehidrasi sampai kering. Selanjutnya teroksidasi oleh oksigen dari udara sehingga menyebabkan mikrobanya mati. Suhu yang digunakan ini, terlalu tinggi untuk wadah-wadah plastik.

Selama pemanasan kering, mikroorganisme dibunuh oleh proses oksidasi. Ini berlawanan dengan penyebab kematian oleh koagulasi protein pada sel bakteri yang terjadi dengan sterilisasi uap panas. Pada umumnya suhu yang lebih tinggi dan waktu pemaparan yang dibutuhkan saat proses dilakukan dengan uap di bawah tekanan. Karena panas kering kurang efektif untuk membunuh mikroba dibandingkan dengan uap air panas maka metode ini memerlukan temperature yang lebih tinggi dan waktu yang lebih panjang. Suhu yang biasa digunakan pada sterilisasi panas kering 160 C paling cepat 1 jam, tapi lebih baik 2 jam.

3. Sterilisasi dengan penyaringan (filtrasi)
Cara kerja dari sterilisasi ini berbeda dari metode lainnya karena sterilisasi ini menghilangkan mikroorganisme melalui penyaringan dan tidak menghancurkan mikroorganisme tersebut. Metode ini tidak dapat membunuh mikroba, mikroba hanya akan tertahan oleh pori-pori filter dan terpisah dari filtratnya. Filter biasanya terbuat dari asbes, porselen. Filtrat bebas dari bakteri tetapi tidak bebas dari virus karena virus tidak akan tersaring dengan metode ini.

Kegunaan:
- Untuk sterilisasi media yang tidak tahan terhadap pemanasan, misalnya Urea Broth ataupun untuk sterilisasi vaksin, serum, enzim, vitamin.
- Meminimalkan kuman udara masuk untuk ruangan kerja secara aseptis

Faktor- faktor dari filter bakteri yaitu keseimbangan permukaan antara bahan dari filter dengan bakteri dari larutan, tekanan yang digunakan, waktu filtrasi, muatan listrik dan filter, pH dari bahan yang disaring dan absorpsi dari protein dan bahan lain (Validation of Pharmaceutical Processes : 151).

4. Sterilisasi kimia
Sterilisasi gas digunakan dalam pemaparan gas atau uap untuk membunuh mikroorganisme dan sporanya. Sterilisasi yang digunakan dalam bidang farmasi untuk mensterilkan bahan-bahan dan menghilangkan dari bahan yang disterilkan pada akhir jalur sterilisasi. Sterilisasi gas biasanya digunakan untuk bahan yang tidak bisa difiltrasi, tidak tahan panas dan tidak tahan radiasi atau cahaya.

Faktor-faktor yang mempengaruhi sterilisasi ini termasuk kelembaban, konsentrasi gas, suhu dan distribusi gas dalam chamber pengsterilan. Penghancuran bakteri tergantung pada adanya kelembaban, gas dan suhu dalam bahan pengemas, penetrasi melalui bahan pengemas, pada pengemas pertama atau kedua, harus dilakukan, persyaratan desain khusus pada bahan pengemas.

Dalam pensterilan digunakan bahan kimia dalam bentuk gas atau uap, seperti etilen oksida, formaldehid, propilen oksida, klorin oksida, beta propiolakton, metilbromida, kloropikrin. Digunakan untuk sterilisasi bahan yang termolabil seperti bahan biologi, makanan, plastik, antibiotik. Aksi antimikrobialnya adalah gas etilen oksida mengadisi gugus –SH, -OH, -COOH,-NH2 dari protein dan membentuk ikatan alkilasi sehingga protein mengalami kerusakan dan mikroba mati.

• Gas Etilen Oksida : Efektif membunuh semua jenis mikroba, virus, fungi, kelemahannya mudah terbakar dan hanya untuk suhu kurang dari 60 C.
•  Gas Ozon : Membunuh pathogen, salah satunya prion (penginfeksi protein)
•  Gas Klorin : Membunuh spora bakteri
•  Formaldehid : Sterilisasi vaksin
•  H2O2 : Membunuh patogen.

5. Sterilisasi dengan radiasi
Sterilisasi radiasi dapat dilakukan baik dengan radiasi elektromagnetik dan radiasi partikel. Metode strerilisasi ini digunakan untuk sterilisasi radiasi pada obat-obat rumah sakit dan laboratorium. Bagaimanapun banyak prosedur sterilisasi industri manggunakan radiasi.

Elektron dipercepat atau sinar gamma dapat digunakan untuk mensterilkan produk-produk pilihan dengan suatu proses berkesinambungan. Jenis radiasi termasuk bagian dari spektrum elektromagnetik, misalnya : sinar ultraviolet, sinar gamma (untuk peralatan kesehatan yang hanya 1x pakai), sinar x (untuk peralatan medis) dan juga sinar katoda elektro kecepatan tinggi (untuk peralatan medis).

Prinsipnya adalah radiasi menembus dinding sel dengan langsung mengenai DNA dari inti sel sehingga mikroba mengalami mutasi. Digunakan untuk sterilisasi bahan atau produk yang peka terhadap panas (termolabil). Ada dua macam radiasi yang digunakan yakni gelombang elektromagnetik (sinar x, sinar γ) dan arus partikel kecil (sinar α dan β). Metode yang paling umum digunakan untuk sterilisasi alat dan bahan pengujian mikrobiologi adalah metode sterilisasi uap (panas lembap) dan metode sterilisasi panas kering.

Media merupakan bahan nutrisi yang disiapkan unutk pertumbuhan mikroba. Agar-agar merupakan kompleks merupakan kompleks polisakarida, dihasilkan oleh alga laut dan digunakan untuk pemadat pada makanan. Keunggulan agar yaitu mencair pada suhuy yang sama dengan air, namun tetap dalam keadaan cair sampain suhu 40 C.

Macam-Macam Media Pertumbuhan

1. Medium berdasarkan sifat fisik
Medium padat yaitu media yang mengandung agar 15% sehingga setelah dingin media menjadi padat.
Medium setengah padat yaitu media yang mengandung agar 0,3-0,4% sehingga menjadi sedikit kenyal, tidak padat, tidak begitu cair. Media semi solid dibuat dengan tujuan supaya pertumbuhan mikroba dapat menyebar ke seluruh media tetapi tidak mengalami percampuran sempurna jika tergoyang. Misalnya bakteri yang tumbuh pada media NfB (Nitrogen free Bromthymol Blue) semisolid akan membentuk cincin hijau kebiruan di bawah permukaan media, jika media ini cair maka cincin ini dapat dengan mudah hancur. Semisolid juga bertujuan untuk mencegah/menekan difusi oksigen, misalnya pada media Nitrate Broth, kondisi anaerob atau sedikit oksigen meningkatkan metabolisme nitrat tetapi bakteri ini juga diharuskan tumbuh merata diseluruh media. Medium cair yaitu media yang tidak mengandung agar, contohnya adalah NB (Nutrient Broth), LB(Lactose Broth).
 

2. Medium berdasarkan komposisi
Medium sintesis yaitu media yang komposisi zat kimianya diketahui jenis dan takarannya secara pasti, misalnya Glucose Agar, Mac Conkey Agar.
Medium semi sintesis yaitu media yang sebagian komposisinya diketahui secara pasti, misanya PDA (Potato Dextrose Agar) yang mengandung agar, dekstrosa dan ekstrak kentang. Untuk bahan ekstrak kentang, kita tidak dapat mengetahui secara detail tentang komposisi senyawa penyusunnya.
Medium non sintesis yaitu media yang dibuat dengan komposisi yang tidak dapat diketahui secara pasti dan biasanya langsung diekstrak dari bahan dasarnya, misalnya Tomato Juice Agar, Brain Heart Infusion Agar, Pancreatic Extract.
 

3. Medium berdasarkan tujuan
A. Media untuk isolasi
Media ini mengandung semua senyawa esensial untuk pertumbuhan mikroba, misalnya Nutrient Broth, Blood Agar.

B. Media selektif/penghambat
Media yang selain mengandung nutrisi juga ditambah suatu zat tertentu sehingga media tersebut dapat menekan pertumbuhan mikroba lain dan merangsang pertumbuhan mikroba yang diinginkan. Contohnya adalah Luria Bertani medium yang ditambah Amphisilin untuk merangsang E.coli resisten antibotik dan menghambat kontaminan yang peka, Ampiciline. Salt broth yang ditambah NaCl 4% untuk membunuh Streptococcus agalactiae yang toleran terhadap garam.

C. Media diperkaya (enrichment)
Media diperkaya adalah media yang mengandung komponen dasar untuk pertumbuhan mikroba dan ditambah komponen kompleks seperti darah, serum, kuning telur. Media diperkaya juga bersifat selektif untuk mikroba tertentu. Bakteri yang ditumbuhkan dalam media ini tidak hanya membutuhkan nutrisi sederhana untuk berkembang biak, tetapi membutuhkan komponen kompleks, misalnya Blood Tellurite Agar, Bile Agar, Serum Agar, dll.

D. Media untuk peremajaan kultur
Media umum atau spesifik yang digunakan untuk peremajaan kultur

E. Media untuk menentukan kebutuhan nutrisi spesifik.
Media ini digunakan unutk mendiagnosis atau menganalisis metabolisme suatu mikroba. Contohnya adalah Koser’s Citrate medium, yang digunakan untuk menguji kemampuan menggunakan asam sitrat sebagai sumber karbon.

F. Media untuk karakterisasi bakteri
Media yang digunakan untuk mengetahui kemempuan spesifik suatu mikroba. Kadang-kadang indikator ditambahkan untuk menunjukkan adanya perubahan kimia. Contohnya adalah Nitrate Broth, Lactose Broth, Arginine Agar.

G. Media diferensial
Media ini bertujuan untuk mengidentifikasi mikroba dari campurannya berdasar karakter spesifik yang ditunjukkan pada media diferensial, misalnya TSIA (Triple Sugar Iron Agar) yang mampu memilih Enterobacteria berdasarkan bentuk, warna, ukuran koloni dan perubahan warna media di sekeliling koloni.

Syarat media yang akan digunakan itu harus mengandung zat hara untuk mikroba, mempunyai tegangan osmosis, tegangan pemukaan, pH, dan lingkungan yg sesuai, tidak toxic, harus steril.

Media berupa Nutrient agar dan Nutrient broth.
Natrium Agar (NA) merupakan suatu karbohidrat kompleks yang diperoleh dari algae marin tertentu, diolah untuk membuang substansi yang tidak dikehendaki. Natrium agar digunakan sebagai bahan pemadat media, agar yang lebur dalam larutan cair akan membentuk gel bila suhu dikurangi sampai di bawah 45°C. Agar tidak merupakan sumber nutrien dari bakteri. Medium (NA) berdasarkan kimianya merupakan medium non sintetik/semi alamiah, berdasarkan konsistensinya merupakan medium padat.

Pada saat penyimpanan, media nutrient agar tidak boleh dibekukan. Hal ini dilakukan untuk menghindari kondensasi dan menetes ke permukaan agar yang dapat memfasilitasi pergerakan organisme dalam koloni

Bahan-bahan untuk NA: ekstrak khamir 3 gram, pepton 5 gram, NaCl 5 gram, agar-agar 15 gram, air suling 1 L.

Sedangkan Nutrien Broth (NB) merupakan gabungan ekstrak daging sapi (sumber karbohidrat) dan pepton (untuk menumbuhkan mikroba). Ekstrak daging sapi merupakan suatu ekstrak jaringan yang empuk, dikonsentrasikan menjadi pasta. Ekstrak daging sapi mengandung substansi jaringan hewan yang dapat larut dalam air, meliputi karbohidrat, senyawa nitrogen organik, vitamin yang dapat larut dalam air, dan garam-garaman. Pepton merupakan produk yang dihasilkan dari bahan-bahan yang mengandung protein seperti aging, kasein, dan gelatin

Pencernaan bahan-bahan protein dicapai dengan asam atau enzim, banyak pepton yang berbeda-beda (bergantung pada protein yang digunakan dan metode pencernaannya) tersedia untuk digunakan dalam media bakteriologis. Pepton berbeda-beda dalam kemampuannya untuk menunjang pertumbuhan bakteri. Pepton adalah sumber utama nitrogen organik, dapat pula mengandung vitamin dan kadang-kadang karbohidrat, bergantung kepada jenis bahan berkandungan protein yang dicernakan.

Nutrient broth merupakan media untuk mikroorganisme yang berbentuk cair. Intinya sama dengan nutrient agar. Nutrient broth dibuat dengan cara sebagai berikut.

• Larutkan 5 g pepton dalam 850 ml air distilasi/akuades.
• Larutkan 3 g ekstrak daging dalam larutan yang dibuat pada langkah pertama.
• Atur pH sampai 7,0.
• Beri air distilasi sebanyak 1.000 ml.

Sterilisasi dengan autoklaf. Fungsi pepton adalah protein dan banyak mengandung N2. Beef ext berisi garam mineral dan lainnya, agar-agar sebagai zat pengentalnya. Perbedaan Natrium Agar (NA) dan Nutrien Broth (NB) adalah NA ada pengentalnya yaitu agar, dan media NA digunakan untuk umum tidak untuk mikroba yang spesifik, sedangkan NB tidak ada pengentalnya dan digunakan untuk bakteri yang spesifik.

https://www.apocil.com/2021/02/alat-kesehatan.html

Berbagi :